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NMY51感受态细胞 XY91007CC

NMY51 Chemically Competent Cell

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NMY51感受态细胞

中文名:NMY51感受态细胞

英文名:NMY51 Chemically Competent Cell

CAS:N/A级别:N/A

分子量:N/A分子式:N/A

纯度:N/A储存条件:-80°C

产品简介

产品储存:-80 ℃保存,一年有效。

产品组成:

11.png


基因型:

MATa, his3Δ200, trp1-901, leu2-3, 112, ade2, LYS2::(lexAop)4-HIS3,ura3::(lexAop)8-lacZ, ade2::(lexAop) 8-ADE2, GAL4


产品说明:

  DUAL membrane系统是DUAL systems BioTech公司开发的专门筛选跨膜蛋白间相互作用的检测技术,它利用分离的泛素系统(split-ubiquitin)直接检测天然状态下膜蛋白间的相互作用,是目前市面上唯一检测膜蛋白间相互作用的酵母双杂系统。此系统采用NMY51酵母菌株,可直接转化质粒进行蛋白互作验证或筛库试验;此菌株Transformation marker为:trp1,leu2-3,报告基因为:HIS3,ADE2和lacZ,第一步通过营养缺陷型报告基因(HIS3,ADE2)进行选择性生长筛选,进一步通过LacZ报告基因进行β-半乳糖分析显色的定量或半定量筛选,三个独立的报告基因,受不同启动子的调控,降低假阳性几率。原理:泛素(ubiquitin)分子量很小,由76 aa残基组成;泛素作为降解信号分子,可以连接另外一种蛋白质的N端,然后被泛素专一性蛋白酶(UBPs)识别,从而导致与泛素相连的蛋白被酶解。泛素可以人为分成两部分:N端(Nub),C端(Cub)。首先,人为地将泛素Nub的3位异亮氨酸突变为甘氨酸(NubI突变为NubG)。这样与Cub的亲合力大大降低,避免了Cub和Nub自我结合或接近的可能性。其次,将Cub部分与人工合成的LexAVP16转录激活因子融合成一个融合蛋白Cub-LexA-VP16。正常条件下NubG不与Cub结合,UBPs也不能识别分离的泛素,转录激活因子也不会被切下来。最后,将要检测的蛋白质分别与NubG和Cub融合,形成bait融合蛋(baitcub-LexA-VP16)和prey融合蛋白(prey-NubG)。如果bait和prey发生相互作用,就会促使NubG和Cub的相互接近,被UBPs识别,导致LexA-VP16的解离,进入核内,从而激活报告基因的转录。此系统可使用四种Bait质粒:pBT3-N,pBT3-SUC,pBT3-STE,pBT3-C,筛选标志均为LEU;三种Prey质粒:pPR3-C,pPR3-SUC,pPR3-STE,筛选标志均为TRP。NMY51感受态细胞经特殊工艺制作,-80 ℃可保存六个月,pGADT7质粒检测转化效率>104cfu/μgDNA。


使用方法:

1. 取NMY51感受态细胞100 µL于冰上融化的,依次加入预冷的目的质粒2-5 µg,Carrier DNA (95-100 ℃,5 min,快速冰浴,重复一次) 10 µL,PEG/LiAc 500 µL并吸打几次混匀,30 ℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。

2. 将管放42 ℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。

3. 5000 rpm离心40 s弃上清,ddH2O 400 µL重悬,离心30 s弃上清。

4. ddH2O 50 µL重悬,涂板,29 ℃培养48-96 h。


注意事项:

1. 感受态细胞最好在冰上融化。

2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。

4. NMY51酵母菌株对高温敏感,最适生长温度为27-30 ℃;高于31 ℃,生长速度和转化效率呈指数下降。

5. 菌落变粉不是污染,是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后,平板上的Adenine被酵母消耗完毕,酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用,然而,有些菌株的ADE2基因被破坏,Adenine合成途径受阻;又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常,所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR)在细胞中积累而使菌落变为粉红色。

6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢,培养基中缺陷成分越多,生长越慢,以转化涂板为例:涂 YPDA平板29 ℃,48 h培养可见直径1 mm克隆;涂SD单缺平板 29℃,48-60 h培养可见直径1 mm克隆,涂SD双缺平板 29℃,60-80 h 培养可见直径1 mm克隆,涂 SD 三缺或四缺平板平板29 ℃,80-90 h培养可见直径1 mm克隆。


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