DNA嵌套缺失试剂盒

产品及特点 本试剂盒用于以一段 DNA 为模板，利用 Exo III 外切酶的 3 到 5 外切活性，定向制备该 DNA 片段的系列缺失。如果将此 DNA 片段克隆到适当的质粒中，则制备的 DNA系列缺失可以转化，得到系列转化子，方便今后的后续分析。其原理示意图如下：

本产品具有下列特点：
1. 一站式，用户不需要单独购买各个成分并进行优化。
2. 定向，Exo III 外切酶只能从 5’突出的 DNA 末端对应的 3’端，或平末端 DNA 的
3’端往 5’端酶切，而从 3’突出的 DNA 末端进行酶切的活性则极低，故只要 DNA片段同时具备上面两种末端结构，就可以控制 ExoIII 外切酶的酶切方向。
3. 最长可处理 10kb 左右的 DNA 片段。

4. 本产品足够 10 次嵌套缺失实验（含 90 个取样点）。

5. 本产品只适用于科研，不能用于临床。

规格及成分

运输及保存 低温运输、-20℃保存, 有效期一年。
自备试剂 质粒 DNA、限制性内切酶、细菌转化试剂
使用方法 
1. 将靶 DNA 片段克隆到任何一个克隆载体中，克隆位点一边必须有能产生 3’突出的内切酶识别位点（此端不被酶切），另一边有能产生 5’突出或平末端的内切酶识别位点（此端将被酶切）。注：产生 3’突出末端的内切酶有 KpnI、PstI、SphI、Sse83871。产生 5’突出末端或平末端的内切酶有 AccI、BamHI、EcoRI、HincII、HindIII、SalI、SmaI、XbaI、XmaI 等。由于 SacI 能在质粒上通过星号活性产生切口，故最好避免使用。ApaI、SacII 和 Sfi 产生的 3’突出末端可以被 Exo III 外切酶酶切，故也不可用。
2. 制备高质量的质粒 DNA。注意：常规离心吸附柱方法制备的质粒 DNA 一般都有 nick（切口），Exo III 外切酶会以这些切口为切入点外切 DNA 片段，产生随机缺失，故最好采用氯化铯密度梯度离心法制备质粒 DNA。也可以用 DNA 连接酶将切口连接上（具体需要参考 DNA 连接酶的使用手册，本产品不提供相关试剂）。
3. 用一个可产生 3’突出的内切酶和一个可产生 5’突出或平末端的内切酶将 5-10ug质粒 DNA 线性化（反应体系不要超过 250uL）。最好选用一种同时跟两种酶兼容的酶反应液。相关操作参考限制性内切酶供应商提供的手册。本试剂盒不提供此步的相关试剂。
4. 取少量酶切产物电泳检测酶切效果。注意：电泳时要用没有酶切的质粒 DNA 做对照。
5. 如果酶切成功，则在内切酶反应液中加入等体积的 DNA 溶解液和 2 倍体积的上柱结合液（如果酶切体系为 250uL，则加入 250uL DNA 溶解液和 500uL 上柱结合液），震荡混匀后全部转移到离心吸附柱中。
6. 室温放置 2 分钟后 13000g 离心 1 分钟。
7. 加入 0.7mL 通用洗柱液，13000g 离心半分钟。弃穿透液。
8. 再加入 0.3mL 通用洗柱液，13000g 离心半分钟。弃穿透液。
9. 13000g 离心半分钟。
10. 在离心吸附柱中加入 90uL DNA 洗脱液 3.0，室温放置 2 分钟。
11. 换新的收集管，13000g 离心半分钟，得到纯化的线性质粒 DNA。标记此管为 0 号。
12. 在 0 号管中加入 10uL 10×Exo III 外切酶缓冲液，吹打混匀放常温待用。
13. 标记 N 个离心管并在每个管中各加入 100uL 1×Mung Bean 核酸酶反应液放常温待用。N 个离心管对应 N 个取样点，本试剂盒足够 90 个取样点。每次实验 N 设置为多少取决于要缺失 DNA 片段的长度。一般每 300bp 需要一个取样点。如果要缺失 2700bp，则需要 N=2700/300=9 个取样点。
14. 在 0 号管中迅速加入 1uL（200U）Exo III 外切酶，轻柔吹打混匀，立即放 37℃并开始计时，1 分钟时迅速转移 10uL 到第 1 号装有 100uL 1×Mung Bean 反应液的管中终止反应。第 2 分钟时迅速转移 10uL 到第 2 号装有 1×Mung Bean 反应液的管中终止反应。依此类推，直到 N 个离心管都完成。注意：如果需要 DNA 缺失长度间隔少于 300bp，也可以每半分钟取样一次。
15. 将 N 个离心管放 65℃5 分钟灭活 Exo III 外切酶，然后放常温短暂离心。
16. 在每管中加入 1.3 uL（约 50U）Mung Bean 核酸酶，轻柔吹打混匀，放 37℃保温 30 分钟。此步将切除单链 DNA 区域。
17. 在每管中加入等体积（100uL）的 DNA 溶解液和 2 倍体积（200uL）的上柱结合液，震荡混匀后全部转移到离心吸附柱中。
18. 重复第 6-第 9 步操作。
19. 在离心吸附柱中加入 40uL DNA 洗脱液 3.0，室温放置 2 分钟。
20. 换新离心管做收集管，13000g 离心半分钟，所得 N 个溶液即为纯化的嵌套缺失系列 DNA 的不同时间点取样。
21. 在 N 个管中分别加入 10 uL 5×Klenow DNA 聚合酶缓冲液（含 dNTP）和 0.4 uL（2 U）Klenow DNA 聚合酶，轻柔吹打混匀，37℃保温 15 分钟以修平 DNA 末端。
22. 取 2.5uL 上步反应液，加到 2.5uL 2×连接液 Mix 中，16℃保温 1 小时。
23. 取 1uL 连接样品转化感受态细胞，制备质粒，筛选缺失长度合适的转化子。

仅用于科研，不能用于临床诊断！所有产品仅供科研使用，不得用于人或动物的治疗等任何其他用途，不为任何个人提供产品和服务。