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无内毒素质粒大量提取试剂盒 XYD9303

本试剂盒采用改良的碱裂解处理方法,及硅胶膜吸附技术,可特异、高效地获得无内毒素高纯度质粒 DNA

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¥ 998.00 /盒
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无内毒素质粒大量提取试剂盒

产品组成

组分规格(10 rxns)
RNase A(10 mg/mL)1.0 mL
Buffer BL25 mL
Buffer I100 mL
Buffer II100 mL
Buffer III100 mL
Endotoxin Removal Buffer60 mL
Buffer W1 (concentrate)60 mL
Buffer EB30 mL

吸附柱 EC (with Collection Tubes)10 个
Collection Tubes10 个

保存条件

常温(10~25℃)保存 12 个月,加入 RNase A 后的 Buffer I 置于 2~8℃保存 6 个月。

产品简介

本试剂盒采用改良的碱裂解处理方法及硅胶膜吸附技术,可特异、高效地获得无内毒素高纯度质粒DNA;柱上直接去除内毒素,操作简便。所得质粒可直接用于细胞转染、酶切、连接、转化、PCR、测序等分子生物学实验。高拷贝质粒,100 mL 菌液通常可获得 500~1500 ug 质粒,低拷贝质粒,200 mL 菌液通常可获得 200~600 ug 质粒。从简便性、得率及纯度综合评价,本试剂盒优于市面上常见品牌。

产品特点

操作简便:柱上快速去除内毒素,其他步骤亦简便高效;

纯度高:沉淀致密,去杂干净;

颜色指示:关键步骤颜色变化指示判断。

适用范围

本品适用于从 100 mL~200 mL 细菌培养物中提取多至 1500 ug 的高纯度无内毒素的质粒 DNA。

注意事项

1. 细菌培养时间一般为 12~16 h,如接种量大则应减少培养时间,过度培养会降低质粒质量甚至导致突变;

2. 每次使用时需观察 Buffer II 和 Buffer III 是否形成沉淀,如有沉淀于 37℃溶解后使用;

3. 用平衡液处理过的柱子建议立即使用,放置时间过长影响使用效果;

4. 第一次使用前,按照瓶上标签向 Buffer W1 中加入 180 mL 无水乙醇;

5. Buffer I 加入 RNase A 后置于 2~8℃保存;

6. 各溶液使用后请立即盖紧盖子;

7. 所有操作均在室温下进行;

8. 质粒提取得率和质量与宿主菌的种类、质粒拷贝数、质粒的稳定性等因素有关。

使用方法

自备:无水乙醇、异丙醇、50 mL 离心管。

1. 柱平衡:向吸附柱中(吸附柱放入收集管中)加入 2.5 mL 的平衡液 Buffer BL(当天处理),10,000rpm 离心 2 min,弃去收集管中滤液,将吸附柱重新放回收集管中;

2. 取 100~200 mL(对于高拷贝质粒,建议 100 mL 菌液;对于低拷贝质粒,建议 200 mL 菌液,最高不超过 300 mL 菌液)过夜培养的菌液,10,000 rpm 离心 2 min,弃上清;

3. 加入 10 mL Buffer I(使用前将试剂盒提供的 RNase A 全部加入),旋涡震荡或用移液器充分吹打使菌体重悬均匀,呈现出均匀混浊的棕红色;

注意:确保菌体沉淀悬浮均匀,含未悬浮菌块会影响裂解,导致提取质粒的浓度及纯度降低。

4. 加入 10 mL Buffer II,温和颠倒混匀使菌体完全裂解,直至溶液变成清亮、粘稠的紫红色;

注意:不可剧烈震荡,以免造成基因组 DNA 的污染;所用时间不要超过 5 min,以免质粒受到破坏,如未完全变得清亮,可能是菌体太多,可增加 Buffer II 的用量,在后续的操作中按倍数增加 Buffer III 的用量。

5. 加入 10 mL Buffer III,立即温和颠倒混匀,可见红黄相间的絮状物产生,继续混匀直至完全变为黄色。10,000 rpm 离心 10 min,小心将上清转移至干净离心管(自备)中(不要带入沉淀);

注意:

1)Buffer III 加入后应立即混合,避免产生局部沉淀,如果上清中还有紫色漂浮物,说明复性不充分,继续混匀至溶液颜色完全变为澄清的黄色;

2)离心后在最上层可能会形成一层致密的漂浮膜,注意不要倒入吸附柱;

3)如果实验室采用吊篮式离心机,不是固定转子,转速达不到 10000 rpm,可以采用吊篮离心的最大转速 4250 g,离心 10 min。

6. 加入 0.3 倍滤液体积的异丙醇,颠倒混匀(加入异丙醇过多容易导致 RNA 污染);

7. 将步骤 6 所得混合溶液转移到平衡好的吸附柱 EC (with Collection Tubes)中,10,000 rpm 离心 1 min,弃收集管中的滤液(吸附柱最大容积为 15 mL,即上步中所得溶液需分 2~3 次过柱);

注意:如果离心机转子倾角较大时,建议加入吸附柱的溶液体积不超 10 mL,以防漏液。

8. 向吸附柱 EC 中加入 5 mL Endotoxin Removal Buffer,静置 5 min,10,000 rpm 离心 1 min,弃滤液;

9. 加入 10 mL Buffer W1(使用前检查是否已加入无水乙醇),10,000 rpm 离心 1 min,弃滤液;

10. 加入 5 mL Buffer W1,10,000 rpm 离心 1 min,弃滤液;

11. 将吸附柱 EC 放回空收集管中,10,000 rpm 离心 5 min;

12. 将吸附柱 EC 置于新的 50 mL 离心管中,开盖放置 5 min,彻底挥发乙醇;

13. 在吸附膜的中间部位加入 1~2 mL 洗脱液 Buffer EB(60~65℃预热效果更好),常温放置 2 min,10,000 rpm 离心 2 min,即得质粒 DNA(如需较多量 DNA,可将得到的溶液重新转入吸附柱,重复此步骤)。 常见问题与解决办法

Q1:质粒 DNA 产量低?

A1:

1) 质粒拷贝数低、质粒>10 kb 或革兰氏阳性菌质粒。应加大菌体使用量,可使用 300~500 mL 过夜培养物,洗脱液 Buffer EB 60℃水浴预热,吸附和洗脱时间可以适当延长,以增加提取效率;

2) 菌种问题。菌种保存过程中存在质粒丢失现象,培养细菌前建议先划线活化,以稳定产量;

3) 细菌未充分裂解。细菌须在 Buffer I/RNase A 中充分重悬或菌体不宜过多,避免成团或过量的细菌无法裂解降低产量。

Q2:质粒 DNA 中有基因组 DNA 污染?

A2:

1) 菌液培养时间太长。菌液培养时间需控制在 12~16 h;

2) 裂解问题。加入 Buffer II 时,必须轻柔颠倒混匀;处理多个样品时,从加入 Buffer II 时算起,总时间不要超过 5 min。

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